Schnell und sicher: Identitätsprüfung mittels Dünnschichtchromatographie
Die Dünnschichtchromatographie (DC) ist eine physikalisch-chemische Analysenmethode, die auf Transportprozessen durch eine mobile flüssige Phase entlang einer stationären festen Phase beruht. Aufgrund unterschiedlicher chemischer Eigenschaften werden die einzelnen Substanzen dabei unterschiedlich weit transportiert. Ein Stoffgemisch kann zudem in seine Einzelbestandteile aufgetrennt werden.
Verschiedene Methoden der Dünnschichtchromatographie
Die stationäre Phase besteht überwiegend aus Kieselgelplatten. Die mobile Phase ist eine Mischung verschiedener Lösungsmittel und wird als Fließmittel bezeichnet.
Im Europäischen Arzneibuch und im Deutschen-Arzneimittel-Codex sind verschiedene Methoden zur Durchführung der Dünnschichtchromatographie beschrieben:
- Ph. Eur. Methode 2.2.27 auf großen DC-Platten
- DAC-Probe 11 auf kleinen Platten
- DAC-Probe 10 auf kleinen HPTLC-Platten mit horizontaler Entwicklung
Die Vorbereitung der Probe, das Fließmittel, die Auswertung sowie auch das Analyseergebnis sind bei allen drei genannten Verfahren gleich. Unterschiede bestehen jedoch hinsichtlich des Materialbedarfs und der benötigten Zeit. Bei kleinen Platten ist die Laufstrecke und damit auch der Zeitbedarf deutlich geringer.
Geräte und Materialien für eine Dünnschichtchromatographie
Zur Durchführung werden eine Dünnschichtplatte, das Fließmittel, eine Entwicklungskammer und Geräte zur Auswertung benötigt.
Die Dünnschichtplatte besteht aus einem geeigneten Material, das auf einer Trägerplatte aus Glas oder aluminiumbeschichtetem Kunststoff aufgetragen ist. Am häufigsten werden dabei polare Kieselgelplatten verwendet.
Mithilfe von Zusätzen wie Gips kann die Festigkeit der Beschichtung erhöht werden. Die Platten werden dann mit dem Zusatz „G“ gekennzeichnet. Im Namen der Platte kann zudem ein Hinweis auf einen Fluoreszenzindikator (F254) oder eine Angabe zum Porendurchmesser des Kieselgels enthalten sein. Welche Platte jeweils zu verwenden ist, wird in der jeweiligen Prüfvorschrift genau angegeben.
Vor der Durchführung der DC wird das jeweilige Fließmittel genau nach Vorschrift hergestellt und in eine Entwicklungskammer gegeben. Diese Kammern bestehen in der Regel aus Glas und haben einen flachen Boden sowie einen dicht schließenden Deckel.
Gut zu wissen: Fließmittel frisch herstellen
Da das Fließmittel häufig leicht flüchtige Bestandteile enthält, sollte es nach Möglichkeit frisch hergestellt werden. Ansonsten kann sich seine Zusammensetzung durch Verdunsten leicht ändern.
Meist werden DC-Platten unter Kammersättigung entwickelt. Dazu werden die Kammerwände innen mit Filterpapier ausgekleidet und die Kammer nach dem Einfüllen des Fließmittels eine vorgegebene Zeit stehen gelassen.
Auftragen der Probenlösung und Entwicklung
Die zu untersuchenden Substanzen werden zunächst in einem geeigneten Lösungsmittel vollständig gelöst. Anschließend wird das vorgeschriebene Volumen mithilfe einer Glaskapillare oder Mikrospritze mehrmals punktförmig aufgetragen.
Dazu wird zunächst am unteren Rand der DC-Platte mit einem weichen Bleistift eine Linie markiert, die Substanzen werden dann auf diese Linie aufgetragen. Die einzelnen Substanzflecken sollten untereinander einen Abstand von mindestens 1 cm haben. Für eine gute Trennleistung ist es auch wichtig, dass die Flecken möglichst klein gehalten werden.
Nach dem Auftragen wird die DC-Platte mithilfe einer Pinzette in die Kammer gestellt und in aufsteigender Richtung entwickelt. Dabei müssen sich die Substanzflecken oberhalb der Oberfläche des Fließmittels befinden. Die Auftragslinie darf also nicht in die Flüssigkeit eintauchen.
Das Fließmittel wandert nun die Platte hinauf und nimmt die einzelnen Substanzen unterschiedlich weit mit. Hat das Fließmittel die vorgegebene Laufhöhe erreicht, so wird die Platte aus der Kammer entnommen und getrocknet.
Auswertung der Dünnschichtchromatographie
Der erste Schritt der Detektion erfolgt meist unter einer UV-Lampe. Dabei muss eine passende UV-Schutzbrille getragen werden. Bestimmte Substanzgruppen können im langwelligen UV-Licht bei 365 nm zur Fluoreszenz angeregt und dann als hell leuchtende Flecken auf dem dunklen Plattenuntergrund erkannt werden.
Enthalten die Platten einen Fluoreszenzindikator, so können Substanzen, welche diese Fluoreszenz mindern, bei 254 nm als dunkle Flecken auf der hell leuchtenden Oberfläche gesehen werden.
Die beobachteten Flecken werden auf der DC-Platte mit einem Bleistift markiert. Meist wird die Platte anschließend mit einem geeigneten Detektionsreagenz besprüht und auf einer Heizplatte erwärmt. Durch Reaktion mit dem Reagenz entstehen gefärbte Zonen oder Flecken.
Das erhaltene Chromatogramm wird nun mithilfe des Rf-Werts ausgewertet. Dieser wird auch als Retentionsfaktor bezeichnet und beschreibt das Verhältnis der Laufstrecke einer Substanz im Verhältnis zur Laufstrecke des Fließmittels.
Der Rf-Wert einer Substanz liegt dabei immer zwischen 0 und 1. Da der Rf-Wert schlecht reproduzierbar ist und zudem stark von den experimentellen Bedingungen abhängt, reicht ein Vergleich des erhaltenen Werts mit Literaturangaben zur Identifizierung einer Substanz nicht aus. Um einen Wirk- oder Hilfsstoff eindeutig zu identifizieren, wird neben der eigentlichen Untersuchungslösung deshalb eine Vergleichslösung aufgetragen.
Gut zu wissen: Was kann als Vergleichslösung verwendet werden?
Zur Herstellung einer Vergleichslösung können Referenzsubstanzen des Europäischen Arzneibuchs (CRS) verwendet werden. Diese Substanzen sind allerdings relativ teuer und normalerweise zur primären Identifizierung eines Stoffes gedacht.
Für die Eingangsprüfung in der Apotheke, also der sekundären Identifizierung, können daher auch Vergleichssubstanzen eingesetzt werden. Dabei kann es sich um einen bereits geprüften Standgefäßrest einer fast aufgebrauchten Charge der gleichen Substanz handeln oder es kann eine andere Charge der Substanz vom gleichen Hersteller verwendet werden.
Bei pflanzlichen Drogen kann die Identifizierung meist durch einen Vergleich der typischen Zonen auf der DC-Platte mit den Angaben in der Prüfvorschrift erfolgen. Für diese Substanzgemische gibt es im DAC/NRF entsprechende Farbabbildungen von DC-Platten mit den vorgeschriebenen Detektionsmethoden.
Dünnschichtchromatographie auf kleinen Platten
Im Rahmen der alternativen Identifizierung von Ausgangsstoffen gibt es im DAC eine Vorschrift für eine Dünnschichtchromatographie auf kleinen Platten (DAC Probe 11). Diese praxisgerechte Prüfmethode ist einfach und schnell durchzuführen und ermöglicht eine sichere Identifizierung von Substanzen.
Als stationäre Phase kommen Fertigplatten mit Kieselgel mit einer mittleren Korngröße zwischen 5 und 40 µm zum Einsatz, die Platten sollen eine Laufstrecke von 60 mm ermöglichen. Die gelösten Substanzen werden mithilfe von Mikro-Kapillaren, die das Auftragen von 2 bis 20 µL Lösung ermöglichen, aufgetragen.
In der jeweiligen Prüfvorschrift sind genaue Angaben zur Herstellung der Untersuchungs- und Vergleichslösung, zum Fließmittel sowie zur Auswertung der Platten zu finden.
Horizontale Entwicklung
Neben der vorgestellten DAC-Probe 11 kann auch die DAC-Probe 10 zur Identifizierung von Ausgangsstoffen eingesetzt werden. Dabei werden Platten mit besonders gleichmäßiger Beschichtung, sogenannte HPTLC-Platten (high performance thin layer chromatography) in speziellen DC-Kammern horizontal entwickelt.
Wann wird die Dünnschichtchromatographie angewendet?
Die Dünnschichtchromatographie kommt häufig zur Feststellung der Identität bei Glucocorticoiden zum Einsatz. Der Wirkstoff Betamethasonvalerat, der zur Herstellung dermaler Zubereitungen verwendet wird, kann beispielsweise mithilfe der Dünnschichtchromatographie nach Probe 11 oder Probe 10 identifiziert werden.
Zusätzlich ist bei beiden Verfahren noch ein nasschemischer Nachweis nötig. Auch Hydrocortisonbutyrat und weitere organische Arzneistoffe wie Dronabinol, Triclosan oder Phenprocoumon können mithilfe der Dünnschichtchromatographie identifiziert werden. Weiterhin kann die Methode auch zur Feststellung der Identität von Dermatikagrundlagen und Tinkturen verwendet werden. Quellen:
https://www.deutsche-apotheker-zeitung.de/daz-az/2015/daz-44-2015/dc-auf-kleinen-platten
https://www.wepa.shop/content/files/WEPA/themen/eingangskontrolle/Kleines_ABC_der_Eingangskontrolle_DINA5_2019.pdf
Rücker, Neugebauer, Willems: Instrumentelle pharmazeutische Analytik, 5. Überarbeitete Auflage 2013, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart.
https://ptaforum.pharmazeutische-zeitung.de/fingerspitzengefuehl-gefragt-111629/seite/4/